1、一种新的增殖GC表型B细胞的培养体系。
为了在体外增殖B细胞，作者制备了三个饲养细胞系，BALB/c3T3成纤维细胞同时稳定转染CD40L和BAFF(40LB)(图1a)，或单独转染CD40L(3T3/40L)或BAFF(3T3/BAFF)。在IL-4存在下，在饲养细胞层上培养幼稚的B细胞。B细胞在CD40LB细胞上增殖，6天后细胞扩增约倍(图1b),而在3T3/40L，3T3/BAFF或3T3细胞上很少增殖。在3T3/BAFF细胞上，抗CD40抗体和IL-4共同刺激B细胞数量增加不到10倍，IL-4和LPS共同刺激B细胞的增殖更少（图1b）。BrdU扩增试验证明扩增不同是由于DNA的合成不同（图1c）。CFSE标记分析表明在CD40LB细胞和IL-4刺激下B包扩增速度更快，而在3T3/BAFF和抗CD40抗体以及IL-4刺激下，B细胞扩增更慢且不均匀（图1d）。表明，饲养层细胞需要膜结合CD40L和BAFF的共表达才能支持B细胞的最佳增殖。
随后通过流氏分析与CD40LB共生长的B细胞表型。IL-4诱导BCR从IgM转换成IgG和IgE，第四天时生成离散群IgG＋和IgE＋离散群。少部分IgG-细胞表达CD＋，除了CD＋细胞外，其余细胞均表现典型的GCB细胞表型：GL7+Fas+CD38low和PNA+（图1e），与免疫小鼠脾脏中的GCB细胞具有同源性（图1f）。因此，在CD40LB上扩增的B细胞，作者称其为体外有诱导的GCB细胞(iGB)。扩增第4天使，iGB细胞中的IgG1＋，IgE＋或IgM＋，CD-细胞群表达丰富的Bcl-6和Bcl-xl蛋白，比体外GCB细胞中的水平还要高（图1g）。
图1.从幼稚B细胞体外诱导和大量扩增表型GCB细胞。(a)iGB细胞培养系统示意图。（b）在40LB上加IL-4(闭合环)、3T3/BAFF加抗CD40Ab(1μgml-1)+IL-4(开环)、3T3/BAFF加LPS(10μgml?1)加IL-4(阴影环)培养活B细胞的累积倍数增加。（c）BrdU细胞增殖试验。（d）将CFSE标记的脾脏幼稚B细胞分别在3T3/BAFF(1μgml?1)加IL-4(粗线)或不加阴影(‘3T3/bAFF’)，或加IL-4(粗线)或不加阴影(‘40lb)的3T3/BAFF上培养3~4天后进行流式分析。用IL-4培养40LB的未标记B细胞作为阴性对照(细线)。（e）流式分析IL-4培养4天或6天的iGB细胞或C57BL/6小鼠脾幼稚B细胞的表面标志。（f）用IL-4培养4天(第4天)的iGB细胞，以及免疫10天小鼠脾B细胞的流式分析。（g）IL-4培养4d的iGB细胞中IgG1+，IgM+，IgE+,CD-细胞群的WB蛋白表达分析。
2、iGB细胞体内培养产生Bmem。
Bmem从GCB细胞发展而来，随后作者探究iGB细胞是否包含Bmem的前体。将表达一个等位标志Ly5.1＋iGB细胞通过静脉转入辐射的C57BL/6(Ly5.2+)小鼠。8周后在小鼠的脾脏中检测到明显的供体来源B细胞(Ly5.1+,CD19+)（图2a）。虽然iGB细胞表达高水平的GCB细胞标志，Fas和GL7，在转移后，它们只表达中等水平的Fas及GL7阴性（图2b，2c）。供体来源的细胞与Na?veB细胞相比表达低水平的CD23，CD和CD43PC标志（图2b）。这些结果表明，大量转移的iGB细胞在受体鼠中存活了很长一段时间，并且获得了Bmem细胞表型，被命名为诱导记忆B细胞（iMB）。
图2.在受体鼠中iGB细胞分化成具有Bmem表型的细胞。（a）来自C57BL/Ly5.1+同系小鼠的iGB细胞纯化后静脉转入辐照的C57BL/6（Ly5.2+）小鼠。八周后混合四只受体鼠的脾脏以及一只为受处理的鼠脾脏进行染色、流氏分析其BCR类型。（b）受体IgG＋（Ly5.1+CD19＋IgD-，红线）或IgM/D＋（Ly5.1+CD19＋IgD＋，蓝线）iGMB细胞以及受体的Na?veB细胞（Ly5.1-CD19＋IgD＋，阴影）通过流氏分析。（c）受体LY5.1+iMB细胞(闭合环，n=8)或LY5.1?天然B细胞和2只常规C57BL/6小鼠(开环，n=10)上B7.1和Fas的表达水平。
3、iMB细胞的产生不依赖于抗原刺激。
Bmem在没有或非常慢的周期下维持，作者探究iMB细胞是否在体内扩增。BrdU诱导的iGB细胞转移到辐照的小鼠中，分析其动力学。转移时，73%的IgG＋为BrdU＋，两周后约30%细胞为BrdU＋，并且持续到八周该细胞比例不变（图3a，b）。表明抑制后2周后的6周内，iBM细胞处于静止状态，此时供体B细胞均无GC表型，但表现为Bmem表型。随后测定BCR信号是否与体内iMB细胞的生成有关。作者用抗-μH（Fab’）2抗体刺激iGB细胞，并不会影响受体脾脏中IgG1＋和IgM/D＋iMB细胞的产生（图3C）。随后作者从两个小鼠品系产生iGB细胞，分别插入/抓基因BCR，特异性识别Hy10抗原。来自两只小鼠的iGB细胞，大约一半为Ag特异性的（图3d，f），在受体中产生iMB细胞的频率与非转基因B细胞相似，而且这些iMB细胞在没有抗原的情况下可以存活3个月。两例iMB细胞均表现为Bmem表型(B7.1+和CD38high)，并保持与转移前细胞相同比例的IgG1+抗原结合B细胞。表明iMB细胞的产生不需要抗原刺激。
图3.iMB细胞的产生和维持不依赖于抗原刺激。（a，b）BrUd或处理的iGB细胞转移到辐照过的C57BL/6小鼠。于移植后2、4、8周分别用流式分析受体小鼠脾脏IgG1+前iGB细胞和IgG1+Ly5.1+CD19+供体iMB细胞的BrdU含量。（c）体外初始BCR刺激对体内iMB生成的影响。（图d-g）从Hy10Ly5.1+小鼠(d)的全脾B细胞或B1-8KiLy5.1+小鼠(f)富集的NP+细胞中获得的iGB细胞。
4、iMB细胞具有Bmem功能。
为了探究iMB细胞是否像Bmen一样可对TD抗原做出应答，作者向Hy10小鼠品系中产生的iMB细胞注射含有OVA的记忆T细胞，然后用OVA-HEL免疫，五天后收集小鼠的脾细胞，通过流式分析（图4a）。未免疫的小鼠表现一个单独的高特异性结合HEL的iMB的细胞群（HELhigh），而免疫小鼠还包含来自供体的对HEL有低结合能力的细胞群。两组小鼠中的HELhigh细胞群表现出Bmem表型，而HELlow细胞表现出浆母细胞表型CD+,CD43+,CD19low,IgG1low,CD38low。荧光显微镜下显示：HEL＋iMB细胞主要定位在外周滤泡区域，散布于MAdCAM-1+边缘窦（图4b-d）。HEL＋IgG1＋细胞主要定位在滤泡外区域，位于红髓或T细胞区与红髓的交接处（图4e-g）。分别将HEL＋iMB细胞、初始B细胞和边缘区B细胞与OVE免疫鼠的脾细胞转移至受体鼠，当用OVA-HEL免疫后，接受HEL＋iMB细胞的小鼠产生抗HEL的Ig1抗体，其他组小鼠未产生（图4h）。表明在Th记忆细胞存在下，iMB细胞快速分化为浆母细胞，当接受TD抗原刺激后分泌抗体，表明iMB细胞从表型和功能上与Bmem相似。
图4.免疫后iMB细胞在体内迅速分化为浆细胞。
5、IL-21促进IL-4诱导的iGB细胞增殖。
IL-21可以扩增GCB细胞以及BCR/CD40B细胞。在40LB饲养细胞上用IL-21原代培养4d，B细胞的增殖能力比IL-4培养低约25倍，且向IgG和IgE转化的频率更低，而且两者协同培养效果也不明显。作者先用IL-4培养iGM细胞，然后再用IL-21或IL-4培养2d（图5a），图5b显示，用IL-21进行第二次培养的扩增效果比IL-4好，并且IgG1＋细胞比IgE多，这与IL-4培养中的情况相反（图5c）。将IL-4培养的iGB细胞命为iGB-4，IL-21二次培养的细胞命为iGB-21。IL-21继续培养至第8天，iGB-21细胞保持对数增殖，扩增10,倍（图5b）。CD＋细胞只有在IgE＋iGB-4细胞群中增加，在IgE＋和IgG＋iGB-20细胞群中培养到第8天时才增加（图5c）。这可能与IL-4和IL-21在TD免疫应答中分别优先促进IgE和IgG1抗体的产生有关。结果表明，IL-21在体外可促进iGB细胞的广泛增殖和对PC的部分分化。
图5.IL-21可促进iGB细胞增殖，并促进IgG1+iGB细胞部分分化为浆母细胞。（a）不同iGB细胞培养示意图。（b）B细胞培养第4、6、8天时累计倍数增加。（c）流式分析iGB细胞的Ig分型、CD表达以及CD-门中Fas和GL7的表达情况。
6、IL-21可逆地抑制iGB细胞向iMB细胞的发育。
为了检测IL-21在体内对iGB细胞向iMB细胞分化的影响，作者将相同数量的IgG1＋CD-Ly5.1＋、iGB-4、iGB-21或iGB-m细胞转移至C57BL/6小鼠，30d后分析。脾脏、淋巴结、腹膜腔以及血液中的Ly5.1＋iMB细胞（图6a）。移植后30~50d，受体脾脏中iMB-4和iMB-m细胞的数量分别为2~5×和0.5~1×，以后逐渐减少（图6b）。而转移iGB-21的小鼠未检测到iMB细胞（图6a，b）。iMB-m和iMB-4具有相同的记忆表型。脾脏中的两种iMB细胞表达了低水平的IL-21R。iMB-m细胞与iMB-4细胞对可溶性Ag的反应功能相当，而来自iGB-21受体小鼠的B细胞没有反应（图6e）。表明，在体外IL-21抑制iGB细胞分化为功能性的iMB细胞。
图6.IL-21可逆性抑制iGB细胞向iMB细胞分化。（a）流式分析空白小鼠和受体小鼠中不同组织细胞的CD19/Ly5.1表达情况。（b）受体鼠脾脏中iMB-4、iMB-21和iMB-m的数量。（c）分析小鼠脾脏中的iMB-4和iMB-m细胞（CD19＋Ly5.1＋）和未处理的B6小鼠中的CD19＋细胞的表达。（d）脾脏iMB-4（粗线）、iMB-m（虚线）或B6小鼠na?veB细胞的标记表达。（e）血清中抗-NPIgG1水平的测定。
7、IL-21促进iGB细胞分化为LLPC。
LLPCs在GC反应的后期产生。因此，作者评估接受来自B1-8ki小鼠中IgG1＋NP＋CD-iGB细胞的小鼠骨髓中抗体形成细胞（AFC）的数量来检测iGB是否分化为LLPC。在四周前接受iGB-21细胞的小鼠中检测到了抗NP抗体的AFCs，但接受iGB-4和iGB-m细胞的小鼠未检测到（图7a）。IgG1＋CD-iGB-21细胞似乎属于浆细胞，因为该细胞表达较高水平的Blimp-1，而在iGB-21细胞培养相同时间的IgG1＋CD-iGB-4或iGB-m细胞中，Blimp-1mRNA表达水平较低（图7b）。第8天，约40%的IgG1＋CD-iGB-21细胞分泌抗NP的抗体（图7c）。结果表明，IL-21可以促进iGB细胞分化为CD-的AFCs，可能是早期的LLPCs前体，但是在缺乏IL-21时，CD-AFCs消失。表明，在任何培养条件下出现的CD＋iGB细胞都表达高水平的Blimp-1mRNA，并且大多数是AFCs。
图7.IL-21促进iGB细胞向浆细胞分化。（a）ELISPOT法检测骨髓中NP特异性IgG1AFCs的频率。（b）Blimp-1转录本在不同细胞中qPCR检测水平。（c）MACS纯化培养6天的iGB-4和iGB-21细胞或培养8天的iGB-21和iGB-m细胞中CD＋或CD-但IgG1＋细胞，并用ELISPOT法检测这些细胞和预纯化的总IgG1+细胞中抗NPIgG1+AFCs的频率。iGB-4、iGB-21和iGB-m分别显示为黑色、灰色和白条。
本研究展示了一种新的培养系统，在该系统中，小鼠na?veB细胞经历了大量的扩增和同型转换，并产生了GC-表型B(iGB)细胞。表达IgG1或IgM/D而不表达IgE的iGB细胞过继转移后在体内可分化为Bmem细胞，并能在同源T细胞的帮助下诱导快速免疫应答。IL-21的二次培养维持了iGB细胞的增殖，同时将其在体内的发育命运从Bmem细胞转移到LLPC，这一结果可以通过在三次培养中取消IL-21而逆转。因此，这个系统能够在体外操纵B细胞的命运，转化为Bmem细胞或LLPC，并将促进GC-B细胞分化程序的剖析。NojimaT,HaniudaK,MoutaiT,etal.In-vitroderivedgerminalcentreBcellsdifferentiallygeneratememoryBorplasmacellsinvivo.NatCommun..doi:10./n